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最新研究揭示:靶向位點特異性N-糖基化B7H3誘導強效抗腫瘤免疫應答

更新時間:2025-06-16      點擊次數(shù):171

Nature communications》是自然出版集團(Nature Publishing Group)旗下的一本開放獲?。?/span>Open Access)綜合性學術期刊,于2010年創(chuàng)刊。

出版周期Bimonthly;

影響因子:14.7

ISSN2041-1723;

發(fā)文量:7910/年;

審稿速度:平均1.0個月;

版面費:USD 6790.00;

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一、研究背景與目標

B7H3CD276)是一種高度N-糖基化的膜蛋白,在多種實體瘤中高表達,通過抑制T細胞功能促進腫瘤免疫逃逸,但具體糖基化位點對其功能的調(diào)控機制尚不明確。N-糖基化影響蛋白折疊、運輸和降解。異常糖基化可導致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中積累并通過ER相關降解(ERAD)途徑清除。該研究聚焦于免疫檢查點分子B7H3N -糖基化修飾,揭示了其在腫瘤免疫逃逸中的關鍵作用,并開發(fā)了靶向糖基化B7H3的單克隆抗體,為腫瘤免疫治療提供了新策略。

關鍵技術總結

1、通過CRISPR-Cas9、sgRNA技術構建敲除細胞系,研究糖基化位點功能;

2、采用WBIPIF、FCM的方法檢測B7H3表達、定位、泛素化及與其他蛋白互作;

3、構建荷瘤小鼠人源化模型驗證B7H3糖基化對腫瘤生長的影響及抗體治療效果

4單克隆抗體篩選技術及SPR篩選特異性抗體并分析其結合特性;

5、TCGA數(shù)據(jù)分析驗證B7H3表達與臨床預后及免疫浸潤的相關性

、主要研究結果

1、B7H3N-糖基化位點對其細胞表面定位和蛋白穩(wěn)定性的影響

構建人類B7H3NQ突變體(將天冬酰胺N突變?yōu)楣劝滨0?/span>Q),包括全突變體8NQ、N91/104/309/322Q(僅這 個位點無法糖基化)及單一位點恢復突變體,示意圖顯示野生型B7H34對糖基化位點(N91/309、N104/322、N189/407、N215/433;MDA-MB-231A549細胞中穩(wěn)定表達突變體,流式分析顯示N91/104/309/322Q突變體的膜結合B7H3水平與8NQ突變體相似,且mRNA水平無顯著差異,排除轉(zhuǎn)錄水平影響小鼠B7H3N91/104Q 突變體在4T1、E0771、B16F10細胞中膜表達量顯著低于野生型,與4NQ 突變體相當用蛋白合成抑制劑CHX處理細胞,發(fā)現(xiàn)N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率快于野生型,而蛋白酶體抑制劑MG132可逆轉(zhuǎn)該降解。MG132 處理后,N91/104/309/322Q突變體的K48-linked泛素化水平顯著升高,提示通過ERAD途徑降解。結果表明,N91/309和 N104/322位點的N-糖基化是B7H3細胞表面定位和蛋白穩(wěn)定性的主要決定因素,缺失這些糖基化會導致B7H3ER中積累并通過蛋白酶體降解。

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1B7H3前體細胞表面定位和穩(wěn)定性維持依賴于其N91/N309N104/N322位點的N-糖基化修飾

2、B7H3糖基化位點N91/309N104/322突變對其亞細胞定位及ER-Golgi轉(zhuǎn)運的影響

隨后,通過免疫熒光染色和共定位分析,在穩(wěn)定表達野生型(WT)或糖基化突變型B7H3 的腫瘤細胞中,觀察B7H3的亞細胞定位及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、ER-Golgi中間區(qū)(ERGIC)和高爾基體標志物的共定位情況。結果表明,野生型B7H3主要分布于細胞膜和核周的高爾基體區(qū)域,N91/104/309/322Q突變體和8NQ突變體的B7H3在細胞質(zhì)中廣泛分布,且與ER 標記物KDEL的共定位顯著增加,提示B7H3ER中積累;另外,野生型B7H3可與ERGIC和高爾基體標志物(TGN38)共定位,而N91/104/309/322Q突變體和8NQ突變體與上述標志物的共定位明顯降低,表明糖基化缺失阻斷了B7H3ER向高爾基體的轉(zhuǎn)運

圖片3.png

2、B7H3N91/309N104/322位點的糖基化缺失會導致其無法正常從ER轉(zhuǎn)運至高爾基體,進而在ER中積累并被降解。

3、糖基化修飾通過調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機制

隨后,通過免疫沉淀-質(zhì)譜(IP-MS)、蛋白質(zhì)降解實驗及泛素化分析,在穩(wěn)定表達野生型(WT)或糖基化突變型B7H3的細胞中,研究糖基化缺失對ERAD途徑的激活作用。

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3、糖基化修飾通過調(diào)控ERAD途徑影響B7H3穩(wěn)定性的分子機制

IP-MS分析結果表明,N91/104/309/322Q8NQ突變體的B7H3ERAD途徑組分(如 p97HRD1、SEL1L)的結合顯著增加,通路富集分析顯示ERAD相關通路顯著激活;使用 p97 ATP酶抑制劑(NMS-873、CB-5083)或蛋白酶體抑制劑(MG132)處理細胞后,N91/104/309/322Q8NQ突變體的B7H3降解被顯著抑制,表明p97介導的ERAD途徑參與其降解;泛素化水平檢測發(fā)現(xiàn)N91/104/309/322Q8NQ突變體的B7H3總泛素化及K48-linked泛素化水平顯著升高,而p97抑制劑處理進一步增強該泛素化免疫共沉淀顯示 N91/104/309/322Q突變體的B7H3ERAD核心組件HRD1SEL1L的結合顯著增強敲低HRD1SEL1L后,N91/104/309/322Q突變體的B7H3降解速率顯著降低,K48-linked 泛素化水平也隨之下降,證實HRD1SEL1LERAD中的關鍵作用。這些結果表明B7H3 N91/309N104/322位點的糖基化缺失會使其被ERAD途徑識別,通過HRD1-SEL1L 復合物介導K48-linked泛素化,進而被p97依賴的蛋白酶體降解。

4、B7H3抑制T細胞增殖和活化依賴于N91/309N104/322位點的糖基化

CFSE標記的人T細胞與輻照的MDA-MB-231細胞共培養(yǎng),結果顯示,表達WT或 N91/104/309/322糖基化B7H3的腫瘤細胞顯著抑制CD4+CD8+細胞的增殖(CFSE稀釋減少),而N91/104/309/322Q8NQ突變體的抑制作用明顯減弱;OT-1 T細胞與OVA肽負載的E0771/B16F10細胞共培養(yǎng),糖基化B7H3組的T細胞增殖抑制更顯著。WTN91/104糖基化B7H3組的IFN-γ+CD8+T細胞頻率顯著低于突變體組,表明T細胞活化受抑制。另外,在小鼠模型中,糖基化B7H3組的穿孔素+TNF+ CD8+T細胞比例降低,進一步證實 T細胞效應功能被抑制。表達WTN91/104糖基化B7H3的腫瘤細胞與活化T細胞共培養(yǎng)后,cleaved caspase-3+腫瘤細胞比例更低,存活腫瘤細胞更多,而突變體組對T細胞殺傷更敏感。此外,糖基化位點突變不影響腫瘤細胞的體外增殖能力(生長曲線、集落形成實驗),且不影響PI3K/AKT/mTORMAPK等增殖相關信號通路,排除非免疫機制的影響。這些結果表明,B7H3N91/309N104/322位點的糖基化是其抑制T細胞增殖和活化的關鍵,該修飾通過維持B7H3的免疫抑制功能,使腫瘤細胞逃避T細胞介導的殺傷。這一結果為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了直接的體外機制證據(jù)。

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4、B7H3N91/309N104/322位點的糖基化對其體外抑制T細胞功能的調(diào)控作用

5B7H3N91N104位點的糖基化對體內(nèi)抗腫瘤T細胞應答的調(diào)控作用

隨后,通過體內(nèi)實驗探究了B7H3N91N104位點的糖基化對抗腫瘤T細胞應答的調(diào)控作用,通過小鼠荷瘤模型和臨床數(shù)據(jù)關聯(lián),驗證了糖基化B7H3對腫瘤免疫逃逸的促進作用。結果表明,重構N91/104糖基化B7H3的腫瘤生長顯著快于N91/104Q突變體,而耗竭 CD8+ T細胞后,兩組腫瘤生長差異消失,提示依賴CD8+ T細胞介導的免疫應答。并 C57BL/6小鼠中獲得類似結果,N91/104糖基化B7H3腫瘤生長更快,且與CD8+ T細胞浸潤減少相關。此外,N91/104糖基化B7H3腫瘤中,IFN-γ+ CD8+ T、TNF+ CD8+ T、IFN-γ+ CD4+ T 及 TNF+ CD4+ T細胞比例顯著低于N91/104Q突變體腫瘤,而調(diào)節(jié)性T細胞(FOXP3+ Treg)無明顯差異。在嚴重免疫缺陷SCID小鼠中,重構N91/104N91/104Q B7H3的腫瘤生長無差異,進一步證實依賴適應性免疫。此外,TCGA分析顯示33種人類癥中,高B7H3 mRNA表達與患者總生存期縮短顯著相關,且B7H3表達與腫瘤內(nèi)CD8+ T 細胞浸潤水平呈負相關這些結果表明B7H3N91N104位點的糖基化通過抑制CD8+ T細胞活化和浸潤,促進腫瘤免疫逃逸。該結果在小鼠模型和臨床數(shù)據(jù)中均得到驗證,為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了體內(nèi)機制依據(jù)。

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5、B7H3N91N104位點的糖基化通過抑制CD8+ T細胞活化和浸潤,促進腫瘤免疫逃逸。

6糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的篩選和鑒定 

通過單B細胞抗體生成技術篩選特異性識別糖基化B7H3的單克隆抗體,并通過流式細胞術、表面等離子體共振(SPR)及免疫印跡等方法驗證其結合特性。用重組人4Ig-B7H3-His 融合蛋白免疫日本白兔,提取脾細胞通過單B細胞技術生成抗體,經(jīng)ELISA和流式細胞術篩選出優(yōu)先結合N91/309/N104/322糖基化B7H3Ab-82;驗證發(fā)現(xiàn),Ab-82可識別野生型(WT)和N91/309/N104/322糖基化B7H3,但不結合N91/309/N104/322Q突變體或去糖基化B7H3PNGase F處理后)。

圖片7.png

6、糖基化特異性B7H3抗體Ab-82的生成過程及其結合特異性驗證

SPR分析顯示Ab-82B7H3的解離常數(shù)(KD)為3.0×10?9M,表明高親和力結合,與商業(yè)抗B7H3抗體(eBioscience)相比,Ab-82對 N91/309/N104/322Q突變體的結合不受HRD1敲除(ERAD抑制)的影響,證實其依賴糖基化的特異性。免疫沉淀(IP)分析發(fā)現(xiàn),Ab-82優(yōu)先結合WTN91/309/N104/322糖基化 B7H3,不結合8NQN91/309/N104/322Q突變體,而商業(yè)抗體可結合所有形式的B7H3;Dot blot 驗證表明,去糖基化的B7H3蛋白無法被Ab-82識別,進一步證明其依賴糖基化位點的結合特性

7、Ab-82的體內(nèi)抗腫瘤機制及人源化抗體的療效及作用機制研究

4T1-hB7H3 荷瘤小鼠中,Ab-820.25–1 mg/kg)顯著抑制腫瘤生長,1 mg/kg組腫瘤重量較對照組降低約70%,無明顯肝腎功能毒性;而在huPBMC-NOG小鼠中5 mg/kg Hu-Ab-82使A549腫瘤體積減少約60%,且腫瘤內(nèi)人類CD8+ T細胞和GZMB+細胞比例顯著增加。Ab-82處理后,MDA-MB-231A549細胞的膜表面B7H3表達量呈劑量依賴性下降,而商業(yè)抗B7H3抗體不影響膜B7H3水平pHrodo Red標記的Ab-8237下可進入腫瘤細胞,且內(nèi)吞量隨時間增加(24 h達峰值),而低溫(4)或內(nèi)吞抑制劑(primaquine)可阻斷該過程;此外,Ab-82優(yōu)先介導WTN91/309/N104/322糖基化B7H3的內(nèi)吞,對8NQ或 N91/309/N104/322Q 突變體的內(nèi)吞作用顯著減弱。同時,Ab-82處理增加4T1腫瘤中 CD4+/CD8+ T細胞比例,且GZMB+細胞(細胞毒性T細胞標志物)數(shù)量顯著增多;免疫組化顯示,Ab-82處理組腫瘤組織的B7H3表達量較對照組降低約50%,伴隨T細胞介導的殺傷增強。這表明Ab-82通過特異性結合糖基化B7H3,誘導其內(nèi)化與降解,解除B7H3T細胞的抑制,從而激活抗腫瘤免疫應答。人源化抗體Hu-Ab-82在人源化模型中驗證了療效與安全性,為靶向糖基化B7H3的免疫治療提供了臨床轉(zhuǎn)化依據(jù)。

四、全文結論

本研究證實B7H3N91/309N104/322 糖基化位點是其發(fā)揮免疫抑制功能的關鍵,靶向該位點的抗體Ab-82可通過誘導B7H3內(nèi)化和降解,激活抗腫瘤T細胞應答。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于糖基化位點的免疫治療藥物提供了新思路,有望成為腫瘤免疫治療的新靶點。

參考文獻:Huang Y, Zhong WQ, Yang XY, Shan JL, Zhou L, Li ZL, Guo YQ, Zhang KM, Du T, Zhang HL, Hu BX, Chen YH, Yang D, Feng GK, Tang J, Zhu XF, Deng R. Targeting site-specific N-glycosylated B7H3 induces potent antitumor immunity. Nat Commun. 2025 Apr 14;16(1):3546. doi: 10.1038/s41467-025-58740-3. PMID: 40229277; PMCID: PMC11997214.


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